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(07)第二届化妆品科技节论文集

8种中药提取物在膏霜类化妆品中的抑菌效能研究

区梓聪，何秋星，陈佩，方电力

(.广东药科大学医药化工学院，广东中山；.广东盛美化妆品有限公司，广东佛山)

摘要：采用纤维素酶法提取8种中药(丁香、鱼腥草、虎杖、黄连、大黄、细辛、甘草和黄芩)，并采用滤纸片法和试管二倍稀释法研究8种中药提取物的抑菌效能。根据其抑菌作用进行复配研究，参考美国个人护理品委员会(PCPC)的抑菌效能测试方法对膏霜配方进行微生物挑战试验。结果表明，在8种中药提取物中，黄连提取物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌的抑制效果最好，其抑菌圈直径分别为(.4±0.4)，(.4±0.6)和(0.7±0.)mm，最低抑菌浓度(MIC)分别为3.5，3.5和5.65g/L。当黄连和黄芩提取物在膏霜配方中的质量分数分别为0.8%和0.6%时，可较强地抑制细菌和真菌的生长，可通过微生物挑战试验。

关键词：化妆品；中药提取物；抑菌效能；纤维素酶

Bacteriuminhibitionefficacyofeightkindsofherbalextractincreamtypecosmetics

OuZi-cong,HeQiu-xing,CHENPei,FANGDian-li

(.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Zhongshan,Guangdong,China;.GuangdongBestBeautyCosmeticsCo.Ltd.,Foshan,Guangdong,China)

Abstract:Extractsofeightkindsofherb(clove,houttuynia,Polygonumcuspidatum,Coptischinensis,rhubarb,asarum,licorice,scutellaria)werepreparedbycellulasemethod;andtheirbacteriuminhibitionefficacywasstudiedbydiscdiffusionmethodandtesttubebrothdilutionmethod.Formulationstudybaseduponthebacteriuminhibitionoftheaforesaidpreservativeswasconducted.WithreferenceofthebacteriuminhibitionefficacytestmethodofAmericanPersonalCareProductCommittee(PCPC),microbialchallengetestsforcreamformulationwasprocessed.Thetestresultsdemonstratedthatintheeightkindsofherbalextracts,theextractofCoptischinensisshowsbestefficacyonStaphylococcusaureus,PseudomonasaeruginosaandEscherichiacoli.Itsdiameterofinhibitionzoneis(.4±0.4),(.4±0.6)and(0.7±0.)mmrespectively,andtheminimuminhibitoryconcentration(MIC)is3.5,3.5and5.65g/Lrespectively.WhenthemassfractionoftheextractofCoptischinensisandscutellariaincreamformulais0.8%and0.6%respectively,itcaninhibitthegrowthofbacteriaandfungieffectivelyandpassthemicrobialchallengetestmeanwhile.

Keywords:cosmetics;herbalextract;bacteriuminhibitionefficacy;cellulase;

化妆品在生产、储存及使用期间难免会受到微生物的污染，使其发生变味、变色及黏度改变等不良变化，产生气体、沉淀，甚至致病菌，从而导致品质劣变，危害人体健康[]。在化妆品中添加防腐剂可以防止产品败坏变质，延长产品货架寿命，确保产品安全性。然而，防腐剂在预防微生物污染的同时，有可能引起刺激症状或接触性过敏等皮肤不良反应，如对羟基苯甲酸酯类和甲醛释放体等，这主要由于合成防腐剂具有一定的毒副作用[]。所以近年来出现了以天然防腐剂代替化学合成防腐剂的趋势[3]，研发使用方便、效果好且无毒副作用的天然防腐剂已受到世界各国的普遍重视。

天然植物的细胞壁由纤维素构成，其中植物的有效成分往往被包裹在细胞壁内。而酶提取法就是利用纤维素酶、果胶酶、蛋白酶等(主要是纤维素酶)，破坏植物的细胞壁，以促使植物有效成分最大限度溶解分离出的一种方法[4]。与传统方法(水蒸馏法、溶剂浸提法、拣煮法等)相比，该法可降低提取条件，在比较温和的条件下分解植物组织，既能保证植物内有效成分的原有性质又能大幅提高提取物的提取率[5]。本研究采用纤维素酶法，酶解提取8种中药(丁香、鱼腥草、虎杖、黄连、大黄、细辛、甘草和黄芩)，研究其提取物对化妆品常见污染菌的抑制作用，根据其抑菌作用进行复配，并将复配提取物应用于膏霜类化妆品中，为研制化妆品用天然防腐剂提供实验依据。

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)ATCC59、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)ATCC、白色假丝酵母(Candidaalbicans)ATCC和黑曲霉(Aspergillusniger)ATCC，广东省微生物研究所；大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，黑曲霉和酵母菌采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基。牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉，均为生化试剂，杭州百思生物科技有限公司；孟加拉红培养基、卵磷脂-吐温80营养琼脂培养基，均为生化试剂，广东环凯微生物科技有限公司；凯松CG，化妆品级，江苏昆山市华新日用化学品有限公司；超纯水，自制；其他试剂均为国产分析纯。打孔器(6.0mm)、涂布器、JHZ-超净工作台，康恒仪器有限公司；HPX-MBE电热恒温培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；T8digital均质器、RW0digital电动数显搅拌机，德国IKA公司。

..提取工艺

称取8种中药粉末各50g分别装入圆底烧瓶内，加入mL蒸馏水浸泡h，以每克样品加入U纤维素酶，于45℃水浴并搅拌，酶解.5h后过滤，将滤液用旋转蒸发仪浓缩至50mL，即得质量浓度为g/mL的8种中药提取物(液体)，5℃高压灭菌0min，4℃保存备用。

..抑菌效能测试

菌悬液制备：将供试菌种在各自适合的斜面培养基和适宜温度条件下于培养箱中培养活化，细菌于(37±)℃培养4h，真菌于(8±)℃培养48h，备用。将活化后的供试斜面培养基用0mL无菌生理盐水稀释制成含细菌量06CFU/mL和含真菌量04CFU/mL的菌悬液[6]。

抑菌圈大小测定：分别将配制好并已灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基倒入无菌培养皿中，每皿5mL，待冷却凝固后移取0.mL被试菌液，加至平皿上，用涂布器涂布均匀。再用无菌镊子将直径为6.0mm的灭菌干燥滤纸片分别放入装有含中药量g/mL的培养皿中，浸泡30min后取出滤纸片，除去多余药液，将滤纸片贴于上述平板表面，每皿贴4片，其中片为空白对照。贴好滤纸片的平板在室温下放置0min后，再放置在培养箱中培养，细菌于(37±)℃培养4h，真菌于(8±)℃培养48h[7]。以0.05%凯松CG为阳性对照，测定抑菌圈直径，每组平行3次，取平均值。

最小抑菌浓度(MIC)测定：采用试管二倍稀释法测定MIC。取0支灭菌试管，各试管分别加入牛肉膏蛋白胨液体培养基和马铃薯葡萄糖液体培养基mL，在第管中加入mL灭菌的g/mL各中药提取物，混匀后吸取mL加入到第管中，依此类推，直至第8管，第8管吸取mL弃去，使其成∶，∶4，∶8……等浓度梯度。向第~8管中分别加入0.mL菌液，第9管不加中药提取物，以凯松CG和菌液作为阳性对照。第0管以培养基和菌液作为空白对照。细菌于(37±)℃培养4h，真菌于(8±)℃培养48h。肉眼观察试管浊度，以不显示浊度的最低药液质量浓度作为MIC。并从以上培养物中分别取0.mL涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基和马铃薯葡萄糖固体培养基平板上，于(37±)℃或(8±)℃下培养后观察，以进一步验证上述试管法的肉眼观察结果[8]。

..3复配防腐体系的微生物挑战试验

选用营养丰富的膏霜进行试验，其配方见表。将A相和B相原料分别搅拌至完全溶解，加热到80~85℃并保温0min，趁热把B相加入A相中，r/min均质min，待温度降至45~50℃时，依次加入C相和D相，搅拌均匀，恢复至室温，制得产品，备用。

表保湿滋润膏霜的配方

Tab.Formationofmoisturizingcream

参照美国个人护理品委员会(PCPC)推荐的微生物挑战试验方法[9-]，称取上述制得的膏霜样品00g，加入混合细菌和混合真菌悬液，使各种细菌和真菌的接种量分别为06和04CFU/g(mL)，然后充分混匀，置于8℃下。在接菌后的第0，7，4，和8天取样分析：准确称取0g样品，加到装有玻璃小球和90mL灭菌生理盐水的锥形瓶内，充分振荡混匀，静置5min，用其上清液作为︰0的稀释液，吸取mL已稀释的样品液，加入9mL灭菌生理盐水中，依次稀释，最终稀释度分别为0-，0-，0-3，0-4，0-5，0-6和0-7，分别取mL已稀释的样品液，加至已灭菌的平皿中，并加入5mL的卵磷脂-吐温80营养琼脂培养基或孟加拉红培养基，充分摇匀，室温下放置0min后，细菌于(37±)℃培养4h，真菌于(8±)℃培养48h，每个稀释度做3个平行，并以不添加防腐体系的膏霜样品作为空白对照。观察结果，并记录菌落数。评判标准：

a.第8天时，样品中含细菌或真菌大于03CFU/g(mL)，该样品不能通过微生物挑战试验，表明样品的防腐体系不能有效地起到抑制微生物的作用，产品在生产、贮藏和使用中很容易受到微生物的污染。

b.第8天时，样品中含细菌或真菌在0~03CFU/g(mL)，该样品有条件地通过微生物挑战试验，即当产品中蛋白质或其他动植物材料成分不是特别高，同时生产的卫生环境符合要求，包装物不易发生二次污染时，该防腐体系可以使用，否则不能。

c.第8天，样品中含细菌或真菌在0~00CFU/g(mL)，表明该样品的防腐体系对微生物有较强的抑杀效果，通过微生物挑战试验，产品在生产、贮藏和使用时不容易受到微生物污染。

d.从第7天起，样品中的细菌或真菌小于0CFU/g(mL)，说明该样品的防腐体系对微生物有特强的抑杀作用，通过微生物挑战试验，产品在生产、贮藏和使用时很不容易被微生物污染。

8种中药提取物的抑菌圈直径见表，抑菌圈直径越大，抑菌活性越大。由表可知，8种中药(除细辛外)提取物对细菌的抑制作用均大于对真菌的抑制。其中，黄连提取物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌的抑制作用最大，抑菌圈直径分别为(.4±0.4)，(.4±0.6)和(0.7±0.)mm，这可能与黄连含有小檗碱、药根碱、黄连碱和巴马亭4种主要生物碱有关[]，而相对于0.05%凯松CG对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌的抑菌圈直径较小。其次为黄芩提取物，其对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑制作用较大[3]，抑菌圈直径为(.0±0.5)和(0.4±0.4)mm，且其对白色假丝酵母的抑制作用在这8种中药提取物中最好，抑菌圈直径为(8.9±0.3)mm，这可能与黄芩含有黄芩素和黄芩苷有关，与文献[4]报道相符。再次为鱼腥草提取物，其对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌的抑制作用较大，抑菌圈直径分别为(0.3±0.4)，(9.6±0.5)和(0.±0.3)mm，与文献[5]研究鱼腥草抑菌作用结果一致，这可能与鱼腥草含有鱼腥草素、甲基正壬酮和酚类物质等有关[6]。丁香、虎杖、大黄和甘草提取物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌有一定的抑制作用，其抑菌圈直径在(7.0~0.0)mm之间，但对白色假丝酵母和黑曲霉的抑制作用相对较差。此外，细辛提取物对这5种菌的抑制效果都差，几乎没有抑制作用。细辛含有正癸烷、黄樟醚、3，5-二甲氧基甲苯等挥发油[7]，它们具有抑菌作用[8]，可能由于本试验采用的酶提法不太适合提取这些成分，造成其提取物抑菌效果较差。

表8种中药提取物对试验菌的抑菌圈直径

Tab.Diameterofinhibitionzoneofeightkindsofherbalextractsonthetestedbacteria

.8种中药提取物的最低抑菌浓度测定结果

8种中药提取物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌、黑曲霉和白色假丝酵母的MIC测定结果见表3。由表3可知，在8种中药提取物中，黄连和鱼腥草提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，其MIC为3.5g/L，而凯松CG的MIC为0.5g/L；其次为黄芩和丁香提取物，其MIC分别为6.5和5g/L；再次为虎杖、大黄和甘草提取物，其MIC为50g/L；细辛提取物的抑菌效果最差，其MIC为g/L。鱼腥草、黄连和黄芩提取物对铜绿假单胞菌的抑制作用最强，其MIC为3.5g/L，而凯松CG的MIC为0.5g/L；其次为大黄和甘草提取物，其MIC为6.5g/L；再次为丁香和虎杖提取物，其MIC为5g/L；细辛提取物的抑菌效果最差，其MIC为g/L。黄连提取物对大肠埃希氏菌的抑制作用最强，其MIC为5.65g/L，而凯松CG的MIC为0.5g/L；其次为鱼腥草提取物，其MIC为3.5g/L；再次为大黄、黄芩、丁香、虎杖和甘草，其MIC分别为5，5，50，和g/L；细辛提取物的抑菌效果最差，其MIC为g/L。鱼腥草、黄连和黄芩提取物对黑曲霉的有一定的抑制作用，其MIC为g/L，而凯松CG的MIC为0.5g/L；其次为甘草，其MIC为g/L；丁香、虎杖、大黄和细辛提取物几乎没有抑菌作用。黄连提取物对白色假丝酵母的抑制作用最强，其MIC为6.5g/L，而凯松CG的MIC为0.75g/L；其次为鱼腥草和大黄提取物，其MIC分别为5和50g/L；再次为丁香、虎杖、黄芩和甘草提取物，其MIC分别为，，和g/L；细辛提取物几乎没有抑菌作用。

表38种中药提取物对试验菌的最低抑菌浓度

Tab.3MICofeightkindsofherbalextractsontestorganisms

.3复配防腐体系在膏霜中的微生物挑战试验结果

根据以上抑菌圈和最低抑菌浓度的测定结果，对黄连和黄芩提取物进行防腐体系复配，考察能否通过微生物挑战试验，复配比例见表4。表5为黄连和黄芩提取物按不同比例的复配后在膏霜中进行微生物挑战试验的检验结果。由表5可知，含质量分数为0.4%黄连提取物的体系~3，在第7天时，细菌和真菌的菌落总数分别在05和03CFU/g以上；在第8天时，随着黄芩提取物质量分数增加，菌落总数虽然相应地有所下降，但仍然在0CFU/g以上，防腐效果微弱，甚至无法通过微生物挑战试验。当黄连提取物的质量分数达到0.6%时(体系4~6)，随着黄芩提取物添加量的增加，体系从第7天至第8天的菌落数总数逐渐递减，即体系防腐效能逐渐增强，且当黄芩提取物的质量分数为0.8%时，体系有条件地通过微生物挑战试验，因体系6从第0天至第4天，其菌落总数减少速度较为平缓，有可能应用于其他化妆品配方体系中不能通过微生物挑战试验。当黄连提取物的添加质量分数为0.8%时(体系7~9)，随着黄芩提取物添加量的增加，体系从第7天开始菌落数总数逐渐递减，当黄芩提取物质量分数为0.6%或0.8%时，第8天时样品菌落总数均小于0CFU/g，可通过微生物挑战试验。为降低生产成本和减少提取物的添加量，最终以黄连和黄芩提取物的质量分数分别为0.8%和0.6%添加于膏霜中。从结果可以得知，黄连和黄芩提取物复配可有效地抑制细菌和真菌的生长，其中黄连提取物在膏霜中的抑菌效能比黄芩提取物强，占主导地位，提高黄芩提取物的添加量可使细菌和真菌在短时间内得到有效的抑制。

表4天然防腐体系复配

Tab.4Corrosionofprotectionsystem

表5膏霜中添加复合天然防腐剂的微生物挑战试验结果

Tab.5Microbialchallengetestingdataofmixedpreservativeincreamformulation

3结论

8种中药(细辛除外)提取物对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希氏菌具有较强的抑制作用，而对黑曲霉和白色假丝酵母抑制稍弱。黄连和黄芩提取物的复配物在膏霜中具有良好的抑菌效果，复配使用能提高防腐体系的抑菌效能，使其在细菌和真菌的抑制中具有较高的活性。当黄连和黄芩提取物的质量分数分别为0.8%和0.6%时，膏霜样品可通过微生物挑战试验。

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