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摘要：目的研究吴茱萸与甘草配伍后发挥减毒作用的化学成分变化。方法采用HPLC指纹图谱结合化学计量学的方法，研究甘草配伍对吴茱萸化学成分的影响，采用层次递进法进一步研究甘草中3种主要成分配伍对吴茱萸中化学成分的影响。结果化学计量学结果表明，吴茱萸单煎液和吴茱萸-甘草药对各自聚为一类，配伍后吴茱萸中多数化学成分的含量显著降低（P＜0.05），实现了吴茱萸配伍甘草前后成分的差异性分析，获取了影响差异的重要化学成分；甘草组分配伍对吴茱萸中化学成分的影响显示，甘草3种主要成分均有不同程度的影响，其中甘草多糖、甘草酸的作用明显，甘草苷对吴茱萸中化学成分的作用较小。结论所建立的指纹图谱结合化学计量学方法能够实现吴茱萸配伍甘草前后的区分，探讨了吴茱萸-甘草配伍减毒的物质基础，为研究吴茱萸-甘草配伍的合理性提供了参考。
吴茱萸EuodiaeFructus（EF）为芸香科吴茱萸属植物吴茱萸Euodiarutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎E.rutaecarpa(Juss.)Benth.var.officinalis(Dode)Huang或疏毛吴茱萸E.rutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果实[1]，具有良好的镇痛、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性[2-4]，生物碱和苦味素类为其主要有效成分[5-8]。文献记载吴茱萸有小毒，近年来临床上关于吴茱萸不良反应的报道日益增多，而生物碱类成分如吴茱萸碱、吴茱萸次碱是潜在的毒性成分[9-10]。甘味中药能降低吴茱萸的毒性，甘草GlycyrrhizaeRadixetRhizoma（GRR）为临床处方中使用频率最高的药物之一，前期研究结果显示甘草对吴茱萸具有“减毒存效”的作用[11-14]。目前，以“甘缓”为切入点，系统研究甘味中药对吴茱萸减毒作用的文献极少，本研究采用中药指纹图谱与化学计量学相结合的方法[15-18]，以吴茱萸-甘草药对为研究对象，研究甘草配伍对吴茱萸中化学成分的影响，探究甘草对吴茱萸发挥减毒作用的物质基础，并采用层次递进的方法研究甘草组分配伍对吴茱萸中化学成分的影响，获取配伍过程中对吴茱萸化学成分影响显著的甘草成分，以期为甘味中药的减毒作用研究提供参考。
1仪器与材料
1.1仪器
Agilent高效液相色谱仪，美国Agilent公司；Mili-QAdvantageA10超纯水仪，美国Miliqore公司；DVCD型十万分之一天平，奥豪斯仪器（常州）有限公司；MultiskanFC酶标仪，美国ThermoFisherScientific公司；FA型万分之一天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；KDM型调温电热套，北京永兴精佳仪器有限公司；XD-DTD型超声清洗仪，南京先欧仪器制造有限公司；HD型高速离心机，上海知信实验仪器技术有限公司。
1.2药品与试剂
收集市售吴茱萸9批，经天津中医药大学中药学专业马琳教授鉴定为芸香科吴茱萸属植物吴茱萸E.rutaecarpa(Juss.)Benth.的干燥近成熟果实，分别来自安徽、广西、江西、四川、贵州，产地代码为AH1、AH2、GX1、GX2、JX1、JX2、SC1、GZ1、GZ2，分别编号为S1～S9；甘草购自北京同仁堂药店，经鉴定为豆科甘草属植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根茎。对照品吴茱萸碱（批号A，质量分数≥99%）、吴茱萸次碱（批号BAS，质量分数＞98%）、柠檬苦素（批号DAS，质量分数＞98%）购自大连美仑生物技术有限公司；对照品新绿原酸（批号DST-，质量分数≥98%）、隐绿原酸（批号DST-，质量分数≥98%）、咖啡酸（批号DST-，质量分数≥98%）购自成都德思特生物技术有限公司；对照品绿原酸（批号Q-9GGW，质量分数96.8%）购自中国食品药品检定研究院；对照品金丝桃苷（批号ZP，质量分数≥98%）、去氢吴茱萸碱（批号WP，质量分数≥98%）购自天津万象恒远科技有限公司；对照品甘草多糖（批号C13A9Y，质量分数为95%）、甘草酸（批号C，质量分数为93%）购自上海源叶生物科技有限公司；对照品甘草酸铵盐（批号wkq，质量分数≥98%）、甘草苷（批号wkq，质量分数≥98%）购自四川省维克奇生物科技有限公司；色谱纯级甲醇、乙腈购自美国Sigma公司；色谱纯级甲酸购自天津科密欧化学试剂有限公司。
2方法与结果
2.1甘草配伍对吴茱萸中化学成分的影响
2.1.1色谱条件色谱柱为WatersXSelect?HSST3（mm×4.6mm，5μm）；流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液；梯度洗脱，上清液：0～20min，7%～11%乙腈；20～23min，11%～12%乙腈；23～35min，12%～25%乙腈；35～40min，25%乙腈；40～45min，25%～40%乙腈；沉淀物：0～5min，20%～30%乙腈；5～8min，30%～52%乙腈；8～23min，52%乙腈；23～30min，52%～%乙腈；全波长扫描确定最佳检测波长：nm（上清液）、nm（沉淀物）；柱温35℃；体积流量1mL/min；进样量10μL。
2.1.2对照品溶液的制备分别称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、金丝桃苷、去氢吴茱萸碱、柠檬苦素、吴茱萸碱、吴茱萸次碱对照品适量，精密称定，置于量瓶中，甲醇溶解，配制成质量浓度分别为1.58、1.54、1.59、0.27、0.47、0.81、2.68、1.15、0.83mg/mL的对照品溶液。
2.1.3供试品溶液的制备
（1）单味中药供试品溶液的制备：称取吴茱萸药材约2g，料液比为1∶10，加水浸泡30min，加热回流提取1h，滤过，4℃冰箱环境中静置24h，r/min离心15min，上清液过0.22μm滤膜，取续滤液作为上清液层备用；取下层沉淀物，加2mL乙醇超声20min溶解，过0.22μm滤膜，取续滤液作为沉淀物层备用。
（2）配伍药对供试品溶液的制备：称取吴茱萸和甘草药材各约2g，料液比为1∶10（另加甘草的吸水量3mL），浸泡30min，加热回流1h，滤过，4℃冰箱环境中静置24h，r/min离心15min，上清液过0.22μm滤膜，取续滤液作为上清液层备用；取下层沉淀物，加2mL乙醇超声20min溶解，过0.22μm滤膜，取续滤液作为沉淀物层，备用。
2.1.4方法学考察
（1）精密度实验：取吴茱萸样本JX1作为供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下连续进样6次，记录色谱图，以分离度好、且信号响应较高的9个成分峰（上清液中6、13、14、16、21号峰，沉淀物中26、29、32、34号峰）为指标，计算保留时间和峰面积的RSD值。结果各成分峰保留时间的RSD%＜2.0%，峰面积RSD%＜4.0%，表明仪器精密度良好。
（2）重复性实验：取吴茱萸样本JX1，按“2.1.3”项下供试品溶液的制备方法平行制备6份，按“2.1.1”项下色谱条件分析并记录色谱图。以分离度好、且信号响应较高的9个成分峰（上清液中6、13、14、16、21号峰，沉淀物中26、29、32、34号峰）为指标，计算保留时间和峰面积的RSD值。结果各成分峰保留时间的RSD＜1.0%，峰面积RSD＜3.0%，表明该方法重复性良好。
（3）稳定性试验：取吴茱萸样本JX1作为供试品溶液，室温条件下放置，按“2.1.1”项下色谱条件，分别于0、2、4、8、12、24h进样，分析并记录色谱图，以分离度好、且信号响应较高的9个成分峰（上清液中6、13、14、16、21号峰，沉淀物中26、29、32、34号峰）为指标，计算保留时间和峰面积的RSD值。结果发现各成分峰保留时间的RSD＜1.0%，峰面积RSD＜2.0%，表明供试品溶液24h内稳定性良好。
2.1.5甘草配伍对吴茱萸中化学成分的影响将9批吴茱萸及吴茱萸-甘草药对按“2.1.1”项下色谱条件分别检测上清液及沉淀物中成分，得到吸收强、特征明显且稳定性好的34个色谱峰作为共有峰，并对色谱峰进行指认。吴茱萸-甘草药对供试品溶液和混合对照品溶液HPLC色谱图如图1所示，9批不同产地吴茱萸样品的指纹图谱如图2所示。
以共有峰的峰面积作为分析变量，采用主成分分析（principal
